RNA純化及獲得

RNA純化及獲得
純化要求
RNA樣品中不應(yīng)存在對酶（如逆轉(zhuǎn)錄酶）有抑制作用的有機(jī)溶劑和過
高濃度的金屬離子。避免其它生物大分子如蛋白質(zhì)、多糖和脂類分
子的污染。排除DNA分子的污染。
純化方法及沉淀
1、有機(jī)溶劑抽提法
氯仿抽提：在使用RNA提取試劑進(jìn)行RNA提取時，常使用氯仿進(jìn)行
抽提，以去除蔗糖、蛋白等雜質(zhì)，并促進(jìn)水相與有機(jī)相的分離，從
而達(dá)到純化RNA的目的。
沉淀：氯仿抽提RNA后，一般采用異丙醇或乙醇來沉淀水相RNA。
加入0.6倍水相體積的異丙醇或與水相等體積的異丙醇，室溫沉淀
20-30分鐘，高速離心，可獲得RNA沉淀。
洗滌沉淀：加入無RNase的75％乙醇，將RNA沉淀振蕩懸浮，使
RNA沉淀中的鹽離子被充分溶解。然后再離心10-30分鐘，再次沉淀
RNA。離心后，小心倒掉上清（注意不要倒出RNA沉淀），隨后快速離
心1-2秒，將殘留在管壁上的乙醇收集到管底后，用小槍頭吸凈，超
凈臺中風(fēng)干1-2分鐘（注意不要晾得太干，否則RNA沉淀不易溶解）。
溶解沉淀：加入適量的RNase-free ddH2O溶解RNA沉淀。
2、硅基質(zhì)吸附法
隨著實(shí)驗(yàn)方法的改進(jìn)，現(xiàn)已發(fā)展出一種采用吸附材料純化核酸的
方法。目前較常見的有：硅基質(zhì)吸附材料、陰離子交換樹脂和磁
珠等。硅基質(zhì)吸附材料因其具有可特異吸附核酸，使用方便、快
捷，不使用有毒溶劑如苯酚、氯仿等優(yōu)點(diǎn)，成為核酸純化的。
Solarbio公司總RNA提取試劑盒就是采用硅基質(zhì)吸附達(dá)到RNA分離
純化目的。通過專一結(jié)合RNA的離心吸附柱和*的緩沖液系統(tǒng)，
使樣品在高鹽條件下與硅膠膜特異結(jié)合，而蛋白、有機(jī)溶劑等雜質(zhì)
不能結(jié)合到膜上而被洗脫，鹽類則被含有乙醇的漂洗液洗滌，后
用RNase-free ddH2O將RNA從硅膠膜上洗脫下來。
一些特殊組織的RNA提取
纖維組織：心臟/骨骼肌等纖維組織提取RNA的關(guān)鍵在于*破碎
組織。這些組織細(xì)胞密度低，單位重量的組織中RNA含量較低，建
議增加起始量。此外，一定要在液氮中將組織*磨碎。
蛋白/脂肪含量高的組織：腦或植物脂肪含量高，酚/氯仿抽提后，
上清含白色絮狀物。必須用氯仿再次對上清進(jìn)行抽提。
核酸RNase含量高的組織：脾、胸腺等組織的核酸和RNase含量很
高。在液氮中研磨，再快速勻漿，能有效滅活RNase，如加入裂解
液后過于粘稠，酚/氯仿抽提不能有效分層，則加入更多裂解液可
以解決此問題。多次酚/氯仿抽提可以去除更多殘留的DNA。如果
加入乙醇后馬上有白色沉淀形成，表明可能有DNA污染，可以在
核酸溶解后用酸性酚/氯仿再次抽提或者用DNaseI消化，去除DNA
污染，植物組織和真菌組織：植物組織和真菌組織比動物組織更為
復(fù)雜，一般選擇在液氮條件下對樣品進(jìn)行研磨，以避免內(nèi)源RNase
降解RNA。如果RNA降解問題不能解決，大多數(shù)情況下是樣品中含
有的雜質(zhì)所致。許多植物和真菌中所含雜質(zhì)如多糖、多酚等都會殘
留，因?yàn)檫@些雜質(zhì)分子與RNA有一些相似性，可與RNA同時沉淀或
者吸附，因此在植物和真菌組織的提取中，需要用一些特別的步驟
或者特別的試劑來去除多糖多酚等雜質(zhì)的干擾和污染。