檸檬酸合酶測試盒 常量可見分光光度法 說明 技術(shù) 文章

檸檬酸合酶（Citrate Synthase，CS）試劑盒

商品貨號：QS1005
英文名稱：Citrate Synthase(CS)Assay Kit
別名：檸檬酸合酶試劑盒 CS Kit 檸檬酸合酶(CS）試劑盒 檸檬酸合酶(CS）測試盒,生化法試劑盒
檢測方法：常量法

測定意義：                           

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

貨號：QS1005-25                                                   規(guī)格：25管/24樣

檸檬酸合酶（citrate synthase，CS）試劑盒說明書

可見分光光度法

注意：正式測定之前選擇 2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。

測定意義：                          

CS（EC 2.3.3.1）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞的線粒體基質(zhì)中，是三羧酸循環(huán)個限速酶，是三羧酸循環(huán)主要調(diào)控位點之一。

測定原理：

CS催化乙酰CoA和草酰乙酸產(chǎn)生檸檬酰輔酶A，進(jìn)一步水解產(chǎn)生檸檬酸；該反應(yīng)促使無色的DTNB轉(zhuǎn)變成黃色的TNB，在 412nm處有特征吸光值。

自備實驗用品及儀器：

可見分光光度計、臺式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1mL玻璃比色皿、研缽、冰、無水乙醇和蒸餾水

試劑組成和配制：

試劑一：液體25mL×1瓶，-20℃保存；

試劑二：液體5mL×1瓶，-20℃保存；

試劑三：液體0.5mL×1支，-20℃保存；

試劑四：液體25mL×1瓶，4℃保存；

試劑五：粉劑×1支，4℃保存，臨用前加入800μL無水乙醇，用不完的試劑4℃保存一周；

試劑六：粉劑×2支，-20℃保存，臨用前加入400μL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

試劑七：粉劑×1支，-20℃保存，臨用前加入800μL蒸餾水，用不完的試劑仍-20℃保存；

樣本的前處理：

組織、細(xì)菌或細(xì)胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

• 稱取約0.1g組織或收集500萬細(xì)胞，加入1mL試劑一和10uL 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。
• 將勻漿600g，4℃離心5min。
• 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心10min。
• 上清液即胞漿提取物，可用于測定從線粒體泄漏的CS（此步可選做）。
• 在步驟④中的沉淀中加入200uL試劑二和2uL 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3秒，間隔10秒，重復(fù)30次），用于線粒體CS測定。

測定步驟：

1、分光光度計預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至412nm，蒸餾水調(diào)零。

2、將試劑四、五、六和七在37℃（哺乳動物）或25℃（其它物種）孵育5min。

3、樣本測定

將上述試劑按順序加入1 mL玻璃比色皿中，加試劑七的同時開始計時，在412nm波長下記錄20秒時的初始吸光度A1和反應(yīng)2min后的吸光值A(chǔ)2，計算ΔA=A2-A1。

CS活性計算：

（1）按樣本蛋白濃度計算：

單位的定義：每mg組織蛋白每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷(V樣×Cpr) ÷T=1100×ΔA÷Cpr

此法需要自行測定樣本蛋白質(zhì)濃度。

（2）按樣本鮮重計算：

單位的定義：每g組織每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /g 鮮重）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（W× V樣÷V樣總）÷T=222.2×ΔA÷W

（3）按細(xì)菌或細(xì)胞密度計算：

單位的定義：每1萬個細(xì)菌或細(xì)胞每分鐘催化產(chǎn)生1 nmol TNB定義為一個酶活力單位。

CS（nmol/min /10⁴ cell）=[ΔA×V反總÷（ε×d）×10⁹]÷（500×V樣÷V樣總）÷T=0.4444×ΔA

V反總：反應(yīng)體系總體積，9×10^-4 L；ε：TNB摩爾消光系數(shù)，1.36×10⁴ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm；V樣：加入樣本體積，0.03 mL；V樣總：加入提取液體積，0.202 mL；T：反應(yīng)時間，2 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/mL；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500萬。